Rabu, 10 September 2008

Selasa, 12 Agustus 2008

Isolasi DNA Tanaman Pisang (Musa sp)

Ringkasan

  1. Daun Pisang Digerus ditambahkan dengan nitrogen cair (Buffer lisis) sebanyak 2 ml kemudian Masukan kedalam tabung effendof 1,5 ml, Inkubasi 1 jam dengan suhu 60 derajat C.Ekstraksi dengan fenol:kloroform:isoamil (25:25:1) dan di homogenkan Sentrifugasi 10.000 rpm selama 10 menit
  2. Ambil Supernatanya dan peletnya dibuang kemudian Pindahkan ketabung effendof baru, Presipitasi (diendapkan) dengan iso propanol dua kali jumlah volume. Homogenkan dan Sentrifugasi 10.000 rpm selama 10 menit
  3. Ambil Peletnya dan buang supernatannya kemudian bilas dengan etanol 70% sebanyak 1 ml, homogenkan dan sentrifugasi 10.000 rpm selama 5 menit.
  4. Ambil Peletnya dan buang supernatannya, kemudian dikering anginkan dan ditambah dengan aquabides
  5. diperoleh sampel DNA


Pembahasan


Metode yang digunakan untuk mengisolasi DNA dari berbagai jenis tanaman, organ tanaman, maupun jaringannya dapat dilakukan dengan berbagai cara. Namun pada intinya terdapat tiga faktor utama yang sangat penting untuk dalam melakukan purifikasi dan ekstraksi DNA secara maksimal. Pertama adalah cara dalam menghomogenkan jaringan tanaman khususnya adalah dinding selnya. Kedua adalah komposisi dari larutan buffer yang ditambahkan dalam penggerusan jaringan tanaman dan yang ketiga adalah penghilangan enzim penghambat-polisakarida.

Tahapan yang dilakukan untuk mendapatkan DNA tanaman pisang adalah penggerusan atau homogenasi daun pisang dengan penambahan nitrogen cair. Fungsinya adalah untuk mempermudah penggerusan dan menjaga agar DNA tidak mengalami kerusakan. Hal ini dilakukan sampai didapatkan daun tanaman pisang yang telah hancur. Selanjutnya dilakukan penambahan buffer ekstrak yang berfungsi untuk melisiskan membran sel dan membran fosfolipid bilayer, atau dalam praktikum kali ini hanya menggunakan nitrogen cair karena memiliki fungsi yang sama dengan bufer ekstrak.

Kemudian dilakukan inkubasi sampel dalam water bath bersuhu 60 derajat C selama 60 menit. Hal ini dilakukan untuk optimalisasi kerja buffer ekstrak. Selanjutnya dilakukan sentrifugasi sampel dengan kecepatan 10000 rpm selama 10 menit dalam suhu 4 derajat C. hal ini dilakukan untuk memisahkan debris dan komponen sel lain yang menjadi pengotor dengan DNA. Hasilnya didapatkan bahwa supernatan berwarna hijau sedangkan pelet berwarna putih kehijauan.

Supernatan yang telah diperoleh selanjutnya diambil dan ditambahkan dengan larutan Phenol:Chloroform:Isolamyl Alkohol (PCI). Hal ini dilakukan untuk mengekstraksi DNA dari kontaminan. Fenol merupakan pelarut organik yang dapat melarutkan protein, lipid dan molekul lain sepergi polisakarida sehingga diharapkan akan didapatkan supernatan yang berisi DNA bebas kontaminan. Setelah pencampuran, homogenat tersebut divorteks untuk optimalisasi homogenasi.

Selanjutnya dilakukan sentrofugasi homogenat dengan PCI tersebut dengan kecepatan 10000 rpm selama 10 menit dalam suhu 4 derajat C. hasil yang didapatkan adalah supernatan dan pelet yang berada pada tiga lapisan lapisan atas berwarna hijau jernih, lapisan tengah berwarna hijau keruh dan pelet yang berwarna hijau tua. Kemudian diambil supernatan pada lapisan paling atas dan ditambahkan larutan Chloroform:Isoamyl Alkohol untuk presipitasi lanjutan. Kemudian kembali dilakukan vorteks dan sentrifugasi.

Untuk memperoleh DNA dari daun tanaman pisang, diperlukan bahan seperti nitrogen cair atau buffer ekstrak (2%CTAB, 100 mM Tris-HCl (pH:8), 20 mM EDTA, 14 M NaCl) steril, Fenol: Chloroform: IsoamylAlkohol (PCI) = 25: 24: 1; Chloroform: Isoamilalkohol (PCI) = 24 : 1, 7.5 M Ammonium acetate,Etanol Absolut, Etanol 70 %, TE Buffer pH 8. EDTA merupakan agen pengkelat yang dapat mengikat ion-ion logam atau ion-ion bermuatan di-positif seperti Ca2+ dan Mg2+ sehingga komponen-komponen di membran terluar sel akan terurai dengan terikatnya molekul yang biasanya mengikat.

Pada prosedur ekstraksi yang telah dilakukan ini digunakan fenol-kloroform yang berfungsi sebagai pendenaturasi protein. Sedangkan DNA dan RNA tidak terdenaturasi karena molekul ini tidak larut didalam pelarut organik seperti fenol-kloroform. Selanjutnya dilakukan presipitasi DNA dengan menggunakan etanol. Hal ini berfungsi sebagai penghilang fenol-kloroform. Sebab apabila fenol-kloroform masih berada di dalam sampel maka dikhawatirkan akan menghambat kerja enzim-enzim restriksi atau enzim lain yang digunakan untuk analisis molekuler.

Hasil yang didapatkan dari presipitasi CI akan terbentuk kembali supernatan dan pelet pada eppendorf, kemudian dilakukan pengambilan supernatan. Supernatan ditambahkan dengan amonium nitrat dan etanol absolut untuk presipitasi lanjutan dan menghilangkan kontaminan. Hasilnya diketahui terbentuk filamen-filamen DNA dalam larutan jernih tersebut. Kemudian dilakukan inkubasi selama satu malam untuk optimalisasi presipitasi.

CTAB memiliki fungsi yang sama seperti SDS, yaitu berfungsi sebagai pelarut lipid dari membran sel. SDS adalah sejenis deterjen yang mampu mengemulsi lipid.
Setelah inkubasi selama semalam dengan etanol absolut dan amonium nitrat dan diketahui filamen DNA selanjutnya dilakukan sentrifugasi kembali untuk mendapatkan pelet DNA. Setelah supernatan dibuang, selanjutnya ditambahkan etanol 70% untuk presipitasi lanjutan. Kemudian dilakukan sentrifugasi sampai didapatkan pelet DNA

Pelet DNA yang didapatkan kemudian dikering anginkan

Rizki S.Si
Biologi Universitas Negeri Padang,
Bioteknologi Tanaman, Universitas Brawijaya, Malang


lebih lanjut hubungi: khi_bio@yahoo.com